심부정맥 혈전증의 급등에서 판막 강성의 역할

Blood

심부 정맥 혈전증은 심부 정맥에서 생명을 위협하는 혈전 발생입니다. 부동 및 혈류 정체는 유체 역학이 정맥 혈전의 시작에 중요한 역할을 한다는 것을 나타내는 전형적인 위험 요소입니다. 그러나 심부정맥 혈전증 개시에서 판막의 물리적 매개변수와 흐름 조건의 역할은 완전히 이해되지 않았습니다. 여기에서 우리는 현장 제작 및 특성화를 사용하여 밸브 탄성의 역할을 탐색할 수 있게 해주는 시험관 내 미세 유체 방법을 설명합니다. 우리의 실험 모델에서 각 판막 첨판의 강성은 독립적으로 제어될 수 있으며 다양한 흐름 조건이 테스트되었습니다. 생성된 복잡한 흐름 패턴은 고스트 입자 속도계를 사용하여 감지되었으며 전혈 및 폴리스티렌 입자의 수성 현탁액을 사용하여 국부적인 혈전 형성과 연결되었습니다. 특히, 유사한 강성의 소엽이 있는 판막은 판막 팁에 혈전 형성이 있었던 반면, 다른 강성의 소엽이 있는 판막은 판막 주머니에 혈전 형성이 있었습니다.

심부정맥혈전증(DVT)와 폐색전증(PE) 포괄해서 정맥 혈전색전증(VTE)

심부정맥혈전증(DVT)은 다리의 심부정맥에 혈전이 형성되는 질환입니다. 이러한 혈전은 불안정해지고 분리되어 폐로 이동하여 폐색전증(PE)으로 알려진 잠재적으로 치명적인 상태를 유발할 수 있습니다. DVT와 PE는 함께 정맥 혈전색전증(VTE)으로 지정되며 매년 약 90만명의 미국인에서 발병하여 높은 이환율과 사망률을 보입니다. 그럼에도 불구하고 DVT 시작의 기본 메커니즘은 불분명합니다. DVT는 소엽 뒤의 정체 영역으로 인해 정맥 판막동에서 시작된다는 일반적인 가정입니다. 일반적으로 동맥경화성 플라크 파열 및 노출된 내피하 기질에서의 혈소판 축적으로 인해 발생하는 동맥 혈전증과 달리, 정맥 혈전증은 내피 박리를 동반하지 않습니다. 정체까지의 혈류 정체는 DVT을 유발하는 주요 요인 중 하나로 간주됩니다. 흐름 중단은 일반적으로 수술 후 침대에 앉는 자세, 마비 또는 장거리 비행과 같은 이유로 사람이 움직이지 않아 발생합니다. 예를 들어, 소아 환자의 경우 3일을 초과하는 움직임의 부족은 정맥 혈전증의 위험 요소로 인식되며 병원에 하루가 추가될 때마다 DVT의 확률이 3% 증가합니다. 나이가 들수록 정맥의 혈류가 느려지고 판막이 더 뻣뻣해지며 이는 노인의 DVT 유병률이 크게 증가하는 것과 관련이 있습니다. 느린 혈류는 정맥벽에 낮은 산소 장력(저산소증)을 일으켜 염증과 유사한 과정을 시작하여 결국 혈전증을 유발합니다. 따라서 위험인자로서의 흐름 감소의 중요성은 흐름의 국부적 특성이 DVT 발병에 주도적인 역할을 한다는 것을 의미합니다. DVT의 생체 내 모델에는 혈전 형성을 유도하기 위해 설치류의 주요 정맥(보통 열등한 대정맥, IVC)의 흐름 제한이 포함됩니다. 이러한 모델은 예를 들어 DVT를 치료하는 약물의 개발에 유용했지만 혈전증을 유발하는 물리적 매개변수(혈류, 판막의 탄성 등)의 중요성을 탐구하는 것은 허용하지 않습니다. 실제로 밸브 내부의 특정 흐름 패턴이 입증되었습니다. 판막 공간에 2개의 역회전 소용돌이가 형성되어 해당 영역에 혈액이 오래 머무를 수 있습니다. 판막 주머니의 혈액 정체 외에도 와류 형성으로 인해 판막 팁에서 혼합이 있습니다. 소용돌이는 세포 및 체액성 혈전 인자의 순환을 촉진하여 상호 작용을 촉진합니다. 정맥 혈전증에서의 역할에도 불구하고 판막 주변의 흐름 패턴은 부분적으로 실제 정맥에서 판막을 요약하는 적절한 시험관 내 모델의 부족으로 인해 거의 조사되지 않았습니다. 보다 최근에는 수치 시뮬레이션이 밸브 모델의 길을 열었습니다. 그러나 실험적 검증이 확실히 부족합니다. 정맥류는 자세, 근육 운동, 수분 공급 및 혈관 직경과 같은 요인에 따라 달라집니다. 더욱이, 국부적 흐름 패턴은 밸브의 기하학적 특성과 기계적 특성에 의해서도 영향을 받습니다. 이러한 기계적 매개변수의 역할 정의는 DVT 시작 메커니즘을 이해하는 데 가장 중요합니다. 따라서 마이크로밀리 유체 공학은 채널의 크기와 유속이 생체 내 조건을 모방하기 위해 정밀하게 제어될 수 있는 고도로 제어된 환경을 허용하는 이상적인 플랫폼을 제공합니다. 예를 들어, Lehmann et al의 작업에서 밸브를 모방한 일련의 견고한 구조는 고정된 유량에서 유동 패턴 변화를 연구하는 데 사용됩니다. 우리의 발견과 함께 이 그룹은 판막 주머니에 두 개의 소용돌이가 형성되는 것을 관찰했습니다. 이 연구는 또한 혈소판 축적 및 활성화에 대한 혈전 개시의 의존성을 보여주었습니다. 그러나 단단한 판막과 연속적인 흐름은 실제 정맥의 일련의 사건을 제대로 반영하지 못할 수 있습니다. 따라서 세포 축적에서 흐름 기하학의 역할을 정확하게 설명하기 위해 우리는 미세 유체 공학을 활용하여 마이크로 채널을 생성하여 정맥의 체외 모델을 개발했습니다. 표준 소프트 리소그래피 기술을 사용하여 PDMS(폴리디메틸실록산)로 만들어졌습니다. 그런 다음 현장 광중합에 의해 폴리에틸렌 글리콜 디 아크릴레이트(PEGDA)로 만든 유연한 밸브를 통합했습니다. 마지막으로 주사기 펌프(연속 흐름의 경우) 또는 압력 컨트롤러(펄스 흐름의 경우)로 유량을 제어했습니다. 이것은 우리에게 판막이 있는 상태에서 앞뒤로 혈액의 움직임을 모방할 수 있는 능력을 주었습니다. 그리고 판막 강성의 변화가 흐름 패턴을 수정하고 물에 분산된 합성 입자와 전혈에서 혈소판의 응집체 형성을 유도한다는 것을 보여주었습니다. . 따라서 우리는 소엽 끝이 초기 축적의 주요 지점이고, 소엽의 강성이 증가하면 판막에 있는 두 소엽의 강성이 같을 때 더 높은 입자 발생이 발생하고 판막에서 소엽의 강성이 같을 때 판막이 다르면 입자가 비대칭 흐름의 결과로 소엽 주머니에 바람직하게 축적됩니다. 우리 모델의 중요한 특징은 근육 펌프의 효과를 모방하여 정맥의 혈류를 가속화하는 박동성 흐름의 사용입니다. 따라서, 우리는 여기에서 판막 강성의 변화가 혈전 형성에 영향을 미칠 수 있음을 보여줍니다. 이 접근 방식은 DVT 시작을 유발하는 물리적 매개변수에 대한 향후 연구에 유용할 수 있습니다.

흐름 패턴의 특성화

유연한 밸브의 존재로 인한 유동 특성의 변화를 평가하기 위해 최근 개발된 전체 광학 기술인 고스트 입자 속도 측정(GPV)을 사용했습니다. GPV는 나노입자와 명시야 현미경을 사용하여 흐름을 추적하는 데 사용되는 반점 패턴을 생성합니다. GPV를 사용하여 자세한 흐름 프로필을 얻을 수 있었습니다. 정맥류는 매우 가변적이므로 유량 범위(1~900 μL/min)와 판막의 탄성(범위 47~100 kPa)이 조사되었습니다. 시험관 내 조건과 생체 내 조건 사이의 유체역학적 유사성을 유지하기 위해 우리는 정맥에 전형적인 생리학적 범위에서 레이놀즈 수(Re)를 유지했습니다. '건강한' 정맥을 모델링하기 위해 유연한 판막(E = 46.7 ± 5.2 kPa)을 사용했습니다. 이 밸브는 밸브 뒤의 정체된 주머니를 비우는 최고 유량에서 최대 범위로 열립니다. 반면에, 밸브가 더 강하면 정체 영역이 증가하고 결과적으로 밸브 뒤에서 유체의 더 높은 체류 시간이 감지됩니다. 이것은 섬유성 조직의 증가로 인해 판막 조직이 덜 유연 해지는 노인을 나타냅니다. 모든 경우에 우리는 밸브 탄성만으로 인한 효과를 강조하기 위해 용기의 강성을 일정하게 유지했습니다. 정맥류는 일반적으로 연속적이지 않습니다. 혈액은 근육 수축(근육 펌프)을 통해 심장으로 다시 밀려나고 판막이 있어 역류가 방지됩니다. 이러한 조건은 밸브를 통한 흐름을 펄스로 만들어 생리학적 조건을 더 잘 모방하도록 밸브를 열고 닫는 압력 컨트롤러를 사용하여 복제되었습니다. 역류가 있는 경우 밸브가 닫히고 흐름이 밸브 포켓에서 재순환되어 소용돌이 형성을 촉진합니다. 밸브를 열고 닫으면 밸브 강성에 비례하여 밸브 포켓에 갇힌 유체를 부분적으로 제거할 수 있습니다.

와류 특성화

밸브의 강성이 증가함에 따라 밸브와 채널 벽 사이에 더 큰 공간이 형성되어 와류가 발생합니다. 판막 소엽 사이의 유속은 주 채널을 통한 속도보다 점점 더 높아져 각 소엽 끝에 하나씩 대칭 와류 쌍의 시작을 담당하는 제트가 형성되었습니다. 이러한 소용돌이는 밸브 팁에서 유체의 체류 시간을 증가시켰습니다. 생체 내 체류 시간이 연장되면 활성화된 세포가 충돌하여 응집체를 형성할 가능성이 더 높아져 혈전 형성 가능성이 증가할 수 있습니다. GPV를 사용하여 수집한 속도 프로파일 맵과 유선을 보면, Re=ρvD/μ로 정의된 레이놀즈 수 Re로 식별되는 더 높은 유속에서 밸브 팁에서 와류가 형성되는 것을 확인할 수 있습니다. 여기서 ρ는 밀도, v 유속, D는 유압 직경 및 μ 수성 현탁액의 점도. 다음으로 우리는 소용돌이의 크기가 유체의 속도와 밸브의 탄성에 어떻게 의존하는지 보여주었습니다. 거듭제곱 법칙에 따라 증가하는 Re에 대한 와류 영역의 의존성을 보면 더 높은 유속은 채널을 따라 소용돌이가 늘어나는 데 기여합니다. 결과적으로 와류 주변의 접선 속도의 적분으로 정의되는 순환도 Re와 함께 증가했습니다. 순환은 소용돌이 내에서 다양하고 경계에서 최대값에 도달했습니다. 미세 유체 채널 내의 제한으로 인해 순환은 대수 거동에 따라 높은 Re에 대한 고원에 도달하는 경향이 있는 반면 소용돌이 면적과 함께 선형적으로 증가합니다. 더 부드러운 밸브가 있는 경우 더 높은 변형이 발생하여 와류 크기가 감소했습니다. 이는 이러한 밸브가 더 단단한 밸브에 비해 동일한 유량에서 더 넓게 열렸기 때문입니다. 이것은 차례로 더 낮은 유속을 가진 제트를 생성하여 더 낮은 접선 속도와 더 낮은 순환을 특징으로 하는 더 작은 와류를 생성했습니다. 실험에 사용된 가장 낮은 유속의 경우 테스트한 가장 높은 영률에서도 와류가 발생하지 않았습니다. 따라서 밸브 강성과 독립적으로 우리는 소용돌이 형성을 관찰하지 못한 임계 유량을 식별했습니다. 이것은 밸브의 탄성, 유속 및 와류 형성 사이의 명확한 연결을 보여주고 밸브의 움직임 범위 및 이에 따른 정체 영역의 크기에 영향을 미치는 가장 중요한 매개변수로서 밸브의 강성을 식별합니다. 특히 DVT의 전형적인 저유량에서 판막엽의 위치는 판막의 강성에 의해서만 결정되며 유량에 대한 의존성은 무시할 수 있습니다. 조사된 Re의 범위를 더 확장하기 위해 더 큰 3D 인쇄 장치가 사용되었습니다. 이를 통해 Re를 최대 163까지 연구하고 GPV로 흐름 패턴을 평가할 수 있었습니다. 건강한 인간 정맥에 대한 전형적인 Re가 더 높을 수 있지만 우리는 낮은 혈류 속도 또는 정체를 특징으로 하는 DVT를 선호하는 조건에 초점을 맞췄습니다.

시험관내 혈전 형성

일반적인 가정은 판막 주머니의 정체로 인해 판막 주머니에서 정맥 혈전증이 발생한다는 것입니다. 그러나 혈전이 어디에서 시작되었는지는 아직 불분명합니다. 이것을 실험적으로 조사하기 위해 연속 또는 펄스 흐름을 사용하여 미세 유체 장치 내에서 폴리스티렌(PS) 입자의 수성 분산액을 흘렸습니다. PS 입자는 Van der Waals 및 고체 표면 사이의 정전기적 상호 작용으로 인해 응집체를 형성하는 경향이 있습니다. 또한, 우리는 3명의 다른 기증자의 형광 표지된 혈소판을 사용하여 전혈을 사용하여 유사한 실험을 수행했습니다. 판막에 축적된 입자 또는 혈소판을 정량화하기 위해 ImageJ를 사용하여 입자 축적의 표면적을 평가했습니다. 이 접근법을 사용하여 우리는 골재 형성에 대한 밸브 강성의 영향을 연구했습니다. 건강한 판막은 유동 정체를 최소화하면서 혈액을 효율적으로 교환할 수 있을 만큼 충분히 유연합니다. 질병이나 노화로 인해 판막이 더 뻣뻣해지는 경향이 있습니다. 또한 강성은 각 전단지에 대해 동일하거나 다른 정도로 변할 수 있다고 추측하는 것이 합리적입니다. 따라서 우리는 판막이 동일하거나(대칭 판막) 다른 강성(비대칭 판막)이 있는 판막에서 입자 덩어리를 조사했습니다.

대칭 밸브

먼저 200nmPS 입자로 연속 흐름 조건을 테스트했습니다. 유속을 높이면 입자 축적이 감소했습니다. 일반적인 실험에서 우리는 5분 동안 100 ms마다 이미지를 획득하고 시간이 지남에 따라 점진적인 입자 축적을 포착하기 위해 골재로 덮인 표면적을 평가하여 입자 축적을 모니터링했습니다. 예를 들어, 50 μL/min의 유속에서 5min 후에 밸브 팁에서 10,500 ± 1300 μm2의 표면적을 차지하는 입자의 큰 축적이 감지되었으며, 이러한 결과는 움직이지 않을 때(장거리 비행/수술/침대에 앉음) DVT가 발생할 가능성이 높기 때문에 DVT 사례와 일치합니다. 다음으로 펄스 흐름을 테스트했습니다. 우리는 3 및 10 μm 직경 PS 입자의 수성 현탁액을 흐르게 하기 위해 1 Hz의 주파수로 0과 100 mbar 사이에서 펄스하도록 설정된 압력 컨트롤러를 사용했습니다. 이 크기는 혈소판 및 적혈구와 유사하게 선택되었습니다. 채널을 통한 최대 유속은 0.2 m/s였습니다. 판막의 움직임으로 인해 연속 흐름과 유사하게 입자가 전단지 끝에 축적되었습니다. 밸브의 탄성을 변화시킴으로써 우리는 강성과 입자 축적 사이의 직접적인 상관 관계를 발견했습니다. 그런 다음 PS 입자의 수성 현탁액에 사용된 것과 동일한 유량에 해당하는 0에서 250 mbar 사이의 전혈을 펄스했습니다. 우리는 PS 입자에서 발견된 것과 유사하게 뻣뻣한 판막(50% PEGDA 및 4% PI로 준비, 영률 약 67.8 ± 5.5 kPa에 해당)의 경우 혈소판이 판막을 형성하는 판막 팁에 우선적으로 축적된다는 것을 발견했습니다. 밸브 팁에 대한 이 응고의 접착력은 PS 입자만큼 강하지 않으며 결과적으로 임계 크기에 도달한 후 분리되고 펄스 흐름이 유지되면 다시 형성됩니다. 그런 다음 동일한 펄스 흐름 조건에 대해 더 낮은 강성의 밸브(30% PEGDA 및 4% PI, 약 46.5 ± 5.2 kPa의 영률에 해당)를 다시 테스트했으며 밸브 또는 메인 채널의 어느 곳에서도 축적을 발견하지 못했습니다. 이것은 밸브 탄성이 흐름 패턴을 수정하고 입자와 혈소판 축적을 억제하는 데 중요하다는 것을 확인했습니다. 또한 유연한 밸브는 흐름 방향의 변화에 ​​더 빠르게 반응하고 팁에 일시적으로 축적되는 혈소판을 잠재적으로 분리할 수 있습니다. 이러한 결과는 혈소판 축적 메커니즘이 밸브의 더 높은 강성으로 인해 발생하는 흐름 조건에만 의존한다는 것을 의미합니다. 이 연구에서 우리는 정맥에 특이적인 맥동 유형의 유동과 유연한 판막 소엽의 상호 작용을 주로 요약하는 것을 목표로 했으며 정확한 유동 전단 응력을 모방하기 위해 덜 강조했습니다. 다른 정맥과 유체역학적 유사성을 유지하기 위해 미세 유체 장치의 유속이 비례적으로 조정되었습니다. 유체역학적 유사성은 전단 응력의 절대값이 우리 장치와 실제 정맥 사이에서 다르다는 사실에도 불구하고 그 역할이 두 시스템의 유체 역학에서 비례적으로 동일함을 의미합니다. 전단이 혈소판 응집에 미치는 영향과 관련하여 중요한 것은 절대값입니다. 이 연구에 사용된 전단 속도 범위에서 혈소판 응집은 GPIIbIIIa와 피브리노겐의 상호작용을 통해 주로 발생하며, 이는 우리 실험에 없었던 가용성 작용제에 의한 인테그린의 활성화를 필요로 합니다. GPIb의 활성화를 필요로 하지 않는 GPIb-von Willebrand factor(VWF) 상호작용을 통한 응집은 10,000 s−1 이상의 전단 속도에서 이 메커니즘으로 완전히 이동하면서 훨씬 더 높은 전단 속도에서 발생합니다. 유연한 밸브에 대한 동일한 전단 조건. 이것은 우리 실험에서 발견된 혈소판 응집이 전단에 의해 유도되지 않을 가능성이 있으며 유체 역학이 관찰된 응집의 주요 원동력임을 시사합니다. 동시에 VWF와 GPIbalpha의 상호 작용은 생체 내 협착증 모델에서 DVT와 관련이 있습니다. 이것은 제한된 혈류로 인해 VWF를 절단하는 효소인 ADAMTS13의 제한된 공급과 결합된 Weibel-Palade 신체에서 VWF의 고접착성 초대형 다량체가 국부적으로 방출되기 때문일 수 있습니다. 따라서 밸브 대칭은 채널을 통한 흐름 패턴 형성에 중요한 역할을 합니다. 동일한 판막의 기계적 특성과 결합된 층류 조건으로 인해 각 판막 판 뒤에 하나씩 두 개의 대칭 와류가 발생합니다.

비대칭 밸브

병든 정맥에서 같은 판막의 소엽이 다른 두께와강성을 가질 수 있다고 보고되었습니다. 따라서 우리는 하나의 전단지가 다른 것보다 더 단단한 판막을 제작하고 이것이 입자 축적에 어떻게 영향을 미치는지 연구했습니다. 비대칭의 경우 흐름 패턴과 궁극적으로 입자 축적에 상당한 차이가 있음을 확인했습니다. 이 조건에서는 GPV 분석 및 녹화된 시간 경과 비디오에 의해 입증된 바와 같이 밸브 후에 와류가 형성되지 않았습니다. 판막의 비대칭으로 인해 보다 유연한 소엽이 펄스 흐름 내에서 이동하는 반면 더 단단한 소엽은 거의 고정되어 있어 판막 뒤의 비대칭 흐름 패턴을 초래합니다. 이것은 전단지 뒤의 밸브 포켓 중 하나에 입자 축적을 촉발하여 대칭의 경우에 비해 더 빠르게 진행되었습니다. 전혈로 반복했을 때, 판막 뒤에 형성된 혈구 응집체가 PS 입자로 만들어진 것에 비해 상당히 작았고 형성하는 데 더 오랜 시간이 필요했지만 실험은 PS 입자에서 얻은 결과와 현저한 유사성을 보였습니다. 참고로, 대칭 조건에서 정방향 및 역류는 모두 밸브 팁에 입자 축적을 일으킨 반면 비대칭 밸브에서는 역류가 밸브 뒤에 입자 축적의 주요 원인이었습니다. 두 경우 모두, 증가된 강성은 DVT로 이어지는 조건과 일치하는 입자 축적을 강화하거나 유발했습니다. 요약하면, 우리는 여기에서 유연 밸브의 제자리 제작과 미세유체 환경에서 조정 가능한 탄성 및 제어된 흐름을 결합하여 혈전증 조건을 생성하는 시험관 내 접근 방식을 제시합니다. 이 새로운 접근 방식을 활용하여 밸브의 강성이 정맥의 흐름 패턴에 어떻게 영향을 미치고 이것이 광학 측정으로 정량화될 수 있는지를 입증할 수 있었습니다. 그런 다음 흐름 거동을 정체 영역 및 와류의 존재와 연결하고 응집체 형성을 담당하는 유연성 및 유속과 같은 중요한 밸브 매개변수를 식별했습니다. 특히, PS 입자와 전혈의 수성 현탁액을 사용하여 다양한 강성, 특히 판막 판 사이의 강성 비대칭이 다른 입자 축적 패턴으로 이어진다는 것을 처음으로 보여주었습니다. 관찰된 샘플과 별도로 대칭 판막의 국부적 축적은 판막 팁에서 발생하고 강성이 증가함에 따라 증가하는 반면 비대칭 판막은 소엽 뒤의 판막 주머니에 축적을 나타냅니다. 비대칭으로 인해 밸브 플랩 주변의 흐름 패턴이 변경되어 입자가 밸브 뒤의 재순환 영역에 갇히게 되었습니다. 우리 시스템에는 Virchow 삼합의 다른 구성요소(혈액 응고 및 혈관벽 변경)가 포함되어 있지 않습니다. 이를 통해 혈전증 시작에서 흐름 기하학의 특정 역할을 보다 정확하게 설명할 수 있지만 우리 모델을 다른 트라이어드 구성요소와 결합하는 연구가 이 연구 라인의 다음 단계가 되어야 합니다. 우리의 결과는 판막이 더 뻣뻣해짐에 따라 노년기에 DVT의 위험이 증가한다는 발견과 일치하며 판막 대칭이 유지되지 않는 상황이 DVT의 위험을 증가시킬 수 있음을 시사합니다. 우리의 연구는 흐름이나 판막의 특성과 같은 물리적 조건이 정맥의 흐름 거동에 책임이 있다는 분명한 증거를 보여줍니다. 유동 기하구조에 영향을 미치는 전체 요소의 복합물, 그 중 일부는 변경할 수 없지만 환자에서 테스트할 수 있으며, 다른 요소도 수정할 수 있습니다. 향후 DVT 확률에 대한 보다 개인화된 예측의 기초가 될 수 있습니다. 후자의 요인 그룹의 수정은 DVT 예방 조치의 복합체에 포함될 수도 있습니다. 우리의 체외 모델은 생체 내에서 일어나는 혈전 형성에 대한 물리적 매개변수의 영향을 반영합니다. 혈전증은 또한 응고 인자와 같은 생화학적 측면의 영향을 받지만, 여기에서 우리는 정맥계의 물리학이 DVT 예측에 잠재적으로 이용될 수 있는 핵심을 어떻게 나타낼 수 있는지 보여줍니다. 주목할만한 예로서, 우리의 결과는 비대칭 강성이 밸브 첨판 뒤의 응집체 형성과 어떻게 연결되는지 강조했습니다. 이 매개변수는 지금까지 조사되지 않았으며 더 높은 DVT 위험의 잠재적 표시일 수 있습니다.