비코딩 RNA는 체세포 비 생식선 조직에서 piRNA 대부분을 차지합니다.

체세포 실험

PIWI상호작용 RNA(piRNA)는 생식선에서 게놈 안정성을 위협하는 전이 요소를 다루기 때문에 게놈의 수호자로 간주됩니다. 최근에는 마우스 뇌, 악성 및 비악성 체조직, 인간 혈장을 비롯한 다른 유형의 세포에서도 piRNA가 보고되었습니다. 이것은 piRNA 기능이 이전에 예상했던 것보다 더 광범위할 수 있음을 시사합니다. 여기에서 우리는 서로 다른 piRNA 데이터베이스에 ncRNA(rRNA, tRNA, YRNA, snRNA 및 snoRNA)의 piRNA 크기 단편과 miRNA 생합성의 중간체에 해당하는 서열의 하위 집합이 포함되어 있음을 보여줍니다. 우리는 이러한 서열의 생합성이 아마도 PIWI 경로와 무관하므로 piRNA 데이터베이스에서 오염 물질로 간주될 수 있다고 논의합니다. 주석이 달린 piRNA의 소수가 이 범주에 속하지만, 이들은 체세포 비 생식선 조직에서 대다수의 piRNA 발현을 설명합니다. ncRNA 단편은 어디에나 있고 풍부하기 때문에 piRNA와의 혼동은 포유동물 생식선 외부의 piRNA 발현 추정에 큰 영향을 미칩니다.

piRNA 기반 선천 면연 시스템이 생식선에서 작동

PIWI상호작용 RNA(piRNA)는 small interfering RNA(siRNA) 및 microRNA(miRNA)와 함께 규제 small RNA의 세 가지 주요 부류 중 하나입니다. 이러한 클래스는 생물 발생 및 표적 조절 방식이 다르지만 Argonaute 단백질을 서열 의존적 방식으로 표적 핵산으로 안내하는 능력과 같은 몇 가지 공통 기능을 공유합니다. Argonaute 단백질은 계통 발생학적으로 Arabidopsis AGO1 및 Drosophila Piwi의 이종 상동체를 포함하는 두 개의 하위 클래스로 세분화됩니다. 전자가 siRNA 및 miRNA에 의한 전사 후 유전자 침묵에 관여하는 반면, PIWI 단백질의 생물학적 기능은 초기에 명확하지 않았지만 초기에는 생식 세포 유지에 필수적인 것으로 나타났습니다. murine PIWI 단백질 MIWI 및 MILI7은 고환에서 새로운 종류의 작은(26~31 nt) RNA에 결합했으며 이를 piRNA라고 불렀습니다. 이러한 piRNA는 개별 게놈 클러스터에 인코딩되었으며, 그 중 많은 부분이 인간의 합성 게놈 영역에 존재했습니다. 동시에, 초파리 PIWI 단백질은 초파리 난소에서 트랜스포존 침묵에 관여하는 것으로 이전에 알려진 생식계열이 풍부한 24~29 nt 작은 RNA 패밀리인 반복 관련 siRNA에 결합하는 것으로 나타났습니다. 이것은 piRNA의 보존된 기능이 생식선에서 게놈 안정성을 위협하는 전이 요소를 다루는 것이라는 개념으로 이어졌습니다. 돌연변이는 생식 세포에 영향을 미칠 때 특히 문제가 되며, 포유동물에서 수정 시 게놈 DNA의 일반화된 탈메틸화는 트랜스포존 발현 및 증식을 유발할 수 있습니다. 이를 피하기 위해, 유전적으로 암호화 및 적응 저항 메커니즘을 모두 포함하는 piRNA 기반 선천 면역 시스템이 생식선에서 작동합니다. 생식선에서 piRNA 경로의 관련성을 감안할 때, piRNA가 처음에 마우스 고환 또는 초파리 난소에서 복제되고 시퀀싱되었다는 것은 놀라운 일이 아닙니다. 그러나 체세포에서 PIWI 단백질과 piRNA의 역할도 문서화되었습니다. PIWI/piRNA 발현은 마우스 및 Aplysia 의 중추 신경계에서 유충 타액선에서 보고되었습니다. PIWI-clade 단백질의 발현이 많은 유형의 체세포암 세포에서 보고되었기 때문에 종양에서 piRNA의 역할도 연구 중입니다. 실제로, Cancer Genome Atlas의 전사체 데이터에 대한 최근 분석은 종양을 비악성 조직과 구별할 수 있는 다양한 체세포 piRNA를 확인했습니다. 최근에, 100개 이상의 piRNA가 정상 인간 혈장에서 시퀀싱되었으며, 이들 중 일부는 시퀀싱된 모든 개인에서 높은 수준으로 검출되었습니다. piRNA가 비배선 조직에서 발현되고 심지어 혈류로 수송된다면, 생식선 모델이 여전히 piRNA 생물학을 연구하는 독특한 환경으로 서 있는지 또는 이러한 비배선 piRNA가 이 유전자 패밀리의 진정한 구성원인지 궁금할 수 있습니다. 최근에 tRNA-Gly의 정자 유래 tRNA 반쪽이 초기 배아에서 유전자 발현을 조절하는 것으로 보고되었습니다. 이 관찰을 통해 우리는 piRNA와 ncRNA 단편 간의 유사성 정도를 연구할 수 있었습니다. 놀랍게도, 우리는 별개의 piRNA 데이터베이스에 있는 상당한 수의 인간 서열이 다른 ncRNA와 100% 동일성을 나타내며, 이러한 모호한 서열이 마우스 뇌, 체세포암 및 혈액에 설명된 대다수의 piRNA를 설명한다는 것을 발견했습니다. 또한, 이러한 서열은 말단에서 우리딘에 대한 편향과 같은 PIWI 의존적 선택의 특징을 공유하지 않습니다. 우리는 또한 이러한 ncRNA 단편에 대한 PIWI 연관성에 대한 증거가 인간에서 드물다는 것을 보여줍니다. 전반적으로 보고된 non-gonadal piRNA는 아마도 선의의 piRNA가 아니기 때문에 포유류의 non-gonadal 세포에서 piRNA 발현이 크게 과대평가되거나 직접 인공물임을 제안합니다.

piRNA 데이터베이스와 non-coding RNA 간의 중첩

RNAdb 2.0 및 piRBase는 과학 문헌에서 추출한 두 개의 piRNA 서열 개요이며 현재 각각 171,551 및 32,826 인간 piRNA를 포함합니다. 이러한 서열의 분석은 U로 시작하는 전사체에 대한 PIWI 단백질의 우선적 결합에 따라 첫 번째 위치에서 우리딘에 대한 강한 편향을 보여주었습니다. 위치 10에서 아데닌에 대한 편향도 분명했지만 신호는 훨씬 약했습니다. 이러한 데이터베이스에 포함된 piRNA 서열과 다른 비암호화 RNA 사이의 중첩을 연구하기 위해 게놈 또는 미토콘드리아로 인코딩된 tRNA, rRNA, snRNA, snoRNA, YRNA 및 miRNA에 대해 각 서열을 정렬했습니다. 제로 불일치 허용으로 우리는 piRNA 또는 ncRNA 단편으로 분류가 모호한 392개(RNAdb 2.0) 및 278개(piRBase) piRNA를 발견했습니다. 이는 각 데이터베이스에 포함된 전체 시퀀스 수의 각각 0.23% 또는 0.85%를 나타냅니다. 모호한 piRNA의 하위 집합은 위치 10에서 우리딘 또는 아데닌을 선호하지 않습니다. 또한 크기 분포는 전체 piRNA 데이터베이스(RNAdb 2.0)의 표준 piRNA와 관련하여 tRNA 반쪽의 약간 더 긴 길이와 일치합니다. 전체적으로 이러한 관찰은 이 하위 집합을 진정한 piRNA로 분류하는 것에 의문을 제기합니다. 이러한 데이터베이스를 생성하는 데 사용된 데이터 소스를 조사한 결과 파리 및 생쥐와 달리 piRBase에 포함된 고유한 시퀀스의 97%가 단 하나의 연구에서 파생된 것으로 나타났습니다. 이 연구는 piRNA가 처음 기술된 중요한 보고서 중 하나입니다. 이 연구에서는 인간 piRNA에 주석을 달기 위해 인간 고환에서의 복제 및 시퀀싱, 25~32 nt 범위의 크기, 다른 알려진 ncRNA와의 유사성 부족의 세 가지 기준을 사용했습니다. 따라서 piRNA 주석은 PIWI 상호작용의 직접적인 증거 없이 크기가 선택된 작은 RNA 라이브러리의 시퀀싱을 기반으로 했으며, 결과적으로 인간 piRNA 데이터베이스에는 PIWI 경로 독립적인 RNA가 포함될 수 있습니다. 다른 모델 유기체에서 RIP-seq 및 CLIP-seq 데이터를 사용할 수 있지만 인간 PIWI 단백질의 면역 침전에 대한 고도로 특이적인 항체가 없기 때문에 인간에서 이러한 연구를 수행할 수 없습니다. 그럼에도 불구하고, 오염되거나 적어도 모호한 piRNA는 분석된 데이터베이스의 전체 서열 수의 1% 미만을 차지합니다. 이 부분 집합이 보고된 인간의 생식선이 아닌 piRNA의 대다수를 대표한다는 사실이 아니라면 이것은 무시할 수 있는 것으로 간주될 수 있습니다.

보고된 체세포 비 생식선 piRNA는 ncRNA 단편입니다.

생식선 외부의 포유류 piRNA 발현에 대한 첫 번째 보고서 중 하나는 마우스 해마에서 발현되는 piRNA의 하위 집합을 설명했습니다. 중요하게는 뮤린 PIWI 단백질 MIWI와의 공동 면역침전이 확인되었습니다. 교양된 뉴런의 제자리 교잡은 수지상 구획에서 이러한 piRNA 중 하나로부터 신호를 보였고, 안티센스 억제는 수지상 척추 형태 형성에서 역할을 제안했습니다. 그러나 우리는 이 연구에서 설명된 가장 풍부한 piRNA가 모두 YRNA, C/D box snoRNA, rRNA 및 심지어 miRNA의 단편이라는 것을 발견했습니다. 가장 풍부한 뇌 piRNA15(DQ541777; mmu-piR-1889)의 LNA 기반 억제에 대해 관찰된 생물학적 효과가 그러한 올리고뉴클레오티드의 실제 표적인 전장 RNY1의 억제에 의해 야기될 수 있는 정도에 대해 질문할 수 있습니다. 인간 혈장에 존재하는 순환하는 작은 RNA에 대한 최근 조사는 총 144개의 piRNA를 밝혀냈으며, 그 중 다수는 모든 염기서열 분석된 개인에서 풍부하고 검출 가능했습니다. 우리는 이러한 piRNA를 자세히 살펴보았고, 평균 발현이 ≥50 RPM인 100% 및 10 RPM 컷오프가 있는 68%가 실제로 ncRNA 단편임을 발견했습니다. 이 점을 더 잘 설명하기 위해 우리는 RNAdb2.0(이 연구에서 사용된 데이터베이스)의 piRNA 읽기를 우리딘으로 시작하거나 시작하지 않는 읽기 또는 ncRNA에 매핑되거나 매핑되지 않은 것으로 나누었습니다. 양성 대조군으로 정상 인간 고환에서 piRNA를 분석했습니다. 예상대로 고환의 piRNA 분포는 데이터베이스의 piRNA 분포와 일치했습니다. 이것은 시퀀스의 수를 사용하거나 그 표현을 고려하면 분명합니다. 대조적으로, 인간 혈장의 piRNA는 우리딘으로 시작하지 않는 서열과 더 놀랍게도 ncRNA에 매핑되는 서열이 매우 풍부했습니다. 우리는 여전히 이러한 ncRNA 단편이 혈류로 분비되는 진짜 piRNA일 가능성을 고려했습니다. 참고로 가장 풍부한 서열은 YRNA의 단편(우리딘으로 시작하지 않음)이었고, 이는 독립적인 혈장 시퀀싱 연구를 분석할 때도 검출될 수 있었습니다. 중요하게도, 동일한 전구체의 5' 말단에 매핑되는 서열은 이 영역에 주석이 달린 piRNA가 없음에도 불구하고 혈장에서도 검출 가능했습니다. 이 프로파일은 다른 조직의 샘플에서 유사하지만 RNY4 3' 단편의 길이 및 극단의 변화는 현재 모델과 호환되지 않는 5' 말단의 엑소뉴클레오리틱 처리 패턴과 유사하기 때문에 일반적으로 PIWI 종속 처리와 일치하지 않습니다. 아마도 이 데이터 세트의 YRNA 단편은 세포외 공간으로 분비될 수 있는 전장 YRNA의 가장 안정적이고 시퀀싱이 쉬운 분해 중간체를 반영합니다. 또는 RNY4의 5' 및 3' 단편은 돌출된 말단과 정확히 21개 뉴클레오티드의 이중 가닥 코어가 있는 한 쌍의 상보적 서열에 해당하기 때문에 Dicer에 의한 처리 결과일 수 있습니다. 이것은 연구 중인 piRNA의 생합성이 아마도 PIWI 경로와 무관하다는 견해를 강화합니다. 우리는 또한 인간 암세포에서 piRNA를 설명하는 또 다른 최근 연구를 분석했습니다. 여기에서 저자들은 The Cancer Genome Atlas의 500개 이상의 정상 조직과 5,000개 이상의 종양 샘플의 전사체 데이터를 분석하여 각각 273개 및 522개의 체세포 비악성 및 악성 piRNA를 발견했습니다. 그러나 우리의 재분석은 암세포에서 가장 풍부한 piRNA가 miRNA 경로 부산물 또는 ncRNA 단편임을 보여주었습니다. 최상위 piRNA는 miRNA let-7a-5p 및 miR-532-5p에 해당하며, 이는 piRNA 데이터베이스와 miRBase 간의 중첩이 다소 작기 때문에 우연히 예상되지 않습니다(P = 8 × 10-9). 나머지 서열은 대부분 C/D box snoRNA, 미토콘드리아 tRNA 및 rRNA의 단편이었습니다. miRNA(일반적으로 22~23 nt)에 해당하는 30개 이상의 뉴클레오타이드 서열을 보고 놀랐지만, 이는 전체 서열 길이에 걸쳐 pre-miRNA와 100% 동일성을 보여 piRNA로의 오분류를 강화했습니다.